Методы введения генов в эмбриональные стволовые клетки

Методы введения генов в эмбриональные стволовые клетки * метады ўвядзення генаў ў эмбрыянальныя ствалавыя клеткі * methods of stem cell gene introduction — ряд методов трансформации эмбриональных стволовых (ЭС) клеток чужеродной ДНК in vitro. Геном ЭС клеток можно изменить путем переноса хромосомы, гибридизации клеток, слияния микроклеток, таргетинга, кальций-фосфатной преципитацией, инфицированием ретровирусными векторами, микроинъекцией ДНК, а также электропорацией. Наиболее широко применяется метод электропорации, при котором частота стабильных трансформантов составляет 10-5-10-6. На частоту трансформации влияет длина гомологичного участка в генной конструкции и геноме ЭС клеток, а также происхождение (напр., линия мышей) используемых последовательностей ДНК и ЭС клеток. Электропорация (см.) при определенных условиях позволяет получить трансформанты, которые содержат одиночные копии в единичном участке генома. Инфицирование рекомбинантными ретровирусами и интеграция чужеродной ДНК проходит по известному механизму: в один сайт на хромосоме встраивается только одна копия и не происходит перегруппировок встроенного материала. Преимуществом ретровирусных векторов является легкость доставки чужеродной ДНК на различных стадиях развития: предимплантационный эмбрион, постимплантационный эмбрион, клетки зародышевых линий, а недостатком — низкая частота инфицированности и ограничение размеров ДНК, переносимой с их помощью (фрагменты не более 10 кб). Внутри клеток вирусная РНК транскрибируется в ДНК при помощи фермента обратная транскриптаза и встраивается в геном хозяина, превратившись в провирус. Важно, что при этом вместо коротких концевых повторов (STR) образуются длинные концевые повторы (LTR), содержащие вирусные транскрипционные элементы, промотор, энхансер и др. Важной особенность ретровирусов является также их способность включать в свой геном фрагменты хозяйской ДНК и переносить их из клетки в клетку. Т. обр., ретровирусы — очень удобный объект для генноинженерных манипуляций, и в настоящее время популярной стала методика создания пакующих клеточных линий с их применением. Чтобы получилась пакующая линия клеток, необходимо под действием сигнала упаковки объединить РНК генамишени вирусного вектора и капсидных белков, которые синтезировались на РНК ретровируса в пакующей линии клеток.